بررسی حضور microrna ها در بخشهای مختلف پلاسمای بیماران مبتلا به سرطان معده

هدف ما در این مطالعه، بررسی و مقایسه سطح بیان mirnaهای انتخابی در بخش های مختلف پلاسمای بیماران مبتلا به سرطان معده و افراد سالم بود. گزارشاتی مبنی بر بیان نابهنجار mirnaها در پلاسما و سرم بیماران مبتلا به سرطان، خصوصا سرطان معده در مقایسه با افراد سالم وجود دارد. با این وجود این گزارش ها همواره همدیگر را تایید نمی کنند. این اختلاف می تواند از تفاوت در قومیت های افراد، تفاوت در روش‎های انجام و نمونه گیری، به عنوان مثال استفاده از پلاسما، سرم و سطح پلاکت ها در نمونه های مورد مطالعه باشد. در این مطالعه، ما پلاسمای افراد ایرانی بیمار را انتخاب و فرض کردیم متغیرها در پلاسما نسبت به سرم، به سبب آماده سازی سریع تر و خطر «ترکیدگی» کمتر سلول های خونی، کمتر خواهند بود. edta به عنوان ماده ی ضدانعقاد و به خاطر اثر مهارکنندگی کم روی واکنش های آنزیمی بعدی در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. علاوه بر این، روش جداسازی پلاکت های قابل مشاهده از پلاسما بهینه شد. پلاسمای خالی از پلاکت به ما اطمینان می دهد که منشاء mirnaهای آشکارشده از پلاکت ها نیست و یا حداقل خطای ناشی از حضور mirnaها از بقایای پلاکت ها قابل چشم پوشی است. برای سالیان متوالی تصور رایج بر حضور mirnaها در ساختارهای exosome با شعاع 80-70 نانومتر استوار بود. بر مبنای این تصور، تحقیقات همواره در جست وجوی mirnaها در کل سرم/پلاسما و یا exosomeهای جداشده از پلاسما متمرکز شده است. مطالعه ای که در سال 2011 انجام پذیرفت، نشان دهنده ی جمعیت دیگری از mirnaها فارغ از exosomeها به صورت متصل به پروتئین های ago2 در افراد سالم بود. این یافته سوال اصلی ما را برانگیخت. آیا می توان این دو جمعیت mirnaها (متصل به پروتئین های ago2 و محدود در exosomeها) را در پلاسمای افراد سالم و مریض از هم تفکیک نمود. علاوه بر این جمعیت این mirnaها در افراد مبتلا به سرطان معده در مقایسه با افراد سالم، چه تفاوتی پیدا خواهد کرد؟ آیا می توان mirnaها را در ساختارهای بزرگ تری مانند وزیکول هایی با شعاع 1 میکرومتر هم پیدا کرد؟ برای پاسخ به این سوال ها، ابتدا به کمک سانتریفیوژ، وزیکول ها و کمپلکس های پروتئینی بزرگ را از پلاسمای خالی از پلاکت جدا کردیم (بخش اول). سپس به کمک فیلترهای پروتئینی پلاسمای حاصل به دو بخش exosomeها (بخش دوم) و بخش خالی از exosome (بخش سوم) تقسیم شد. داده های اندازه گیری شعاع ذرات حاکی از جدا شدن ویزکول ها و نشان دهنده ی حضور ذرات 80 نانومتری در بخش دوم و حذف همین ذرات در بخش سوم بود. در این مطالعه ما از روش real time pcr بر پایه probe برای آشکارسازی mirnaها استفاده کردیم. در ابتدا هدف ما اندازه گیری مقدار مطلق mirnaها(تعداد mirnaها) بود، بنا براین با انجام واکنش ivt به استفاده از این روش برروی mirnaهای ساخته شده و mirnaهای استخراج شده از پلاسما پرداختیم. بنا به عدم تطابق بازده واکنش pcr روی rnaهای ساخته شده و استخراج شده، ما روش نسبی اندازه گیری را انتخاب نمودیم. جالب آنکه با تکمیل مطالعه توانستیم تمام mirnaهای انتخابی را در هر سه بخش تهیه شده از پلاسمای بیمار و سالم آشکار کنیم. بنابراین آشکارسازی rnaها در بخش اول می تواند به خاطر حضور این مولکول ها در وزیکول ها یا ساختارهای بزرگ تر و یا حتی آلودگی ناشی از پلاکت ها باشد. مطالعات بیشتر در خصوص حضور و اهمیت mirnaها در بخش اول ضروری و کمک کننده خواهند بود. حضور mirnaها در بخش دوم می تواند به خاطر وجود exosomeها باشد، در حالی که حضورشان در بخش سوم حاکی از حضور این مولکول ها در ساختارهایی بجز exosomeها است. تحلیل داده ها نشان دهنده ی الگوی بیان متفاوت و مستقل در بخش های مختلف پلاسما در افراد بیمار و سالم است. با وجود این به خاطر تعداد محدود نمونه ها، تفاوت آماری زیادی بین داده ها یافت نشد. الگوی بیان به دست آمده، متفاوت از گزارشات قبلی در این زمینه است که می تواند به خاطر تفاوت در قومیت افراد مورد مطالعه ، تفاوت در روش آماده سازی نمونه و بخش کردن پلاسما باشد. در صورت تایید نتایج به دست آمده با مطالعات بیشتر، این نتایج در زمینه ی ارتباط mirnaها و سرطان بسیار امیدوارکننده خواهند بود.